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引物的合成及純化方式
點(diǎn)擊次數(shù):1575 更新時(shí)間:2022-10-24

  目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成,由待合成引物的3'端向5'端合成延伸,相鄰的核苷酸通過(guò)3'→5'磷酸二酯鍵連接。

固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下:

1) 用三lv乙酸去除固相載體5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT,獲得游離的5'-羥基;

2) 將亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體與活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng);

3) 由于無(wú)法*的5'-羥基都參與縮合,可能有極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%),可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成,這種短片段可以在純化時(shí)分離掉;

4) 在氧化劑的作用下,亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯,使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定。

經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟,一個(gè)脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復(fù)以上步驟,直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過(guò)程中可以監(jiān)控脫下的保護(hù)基團(tuán)DMT的顏色可以初步判定合成效率。

引物純化方式選擇:

1、C18柱脫鹽:

有人稱(chēng)其為簡(jiǎn)易反相柱,它對(duì)DNA有特異性的吸附,可以被有機(jī)溶解洗脫,但不會(huì)被水洗脫,所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實(shí)際上,它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會(huì)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對(duì)于需要用于測(cè)序、克隆的引物不能使用這個(gè)級(jí)別。
2、OPC純化: 

OPC純化是根據(jù)DNA保護(hù)基(DMTr基)和Cartridge柱中樹(shù)脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。
3、PAGE純:

PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,對(duì)DNA片段進(jìn)行分離,然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,純化后的DNA純度大于95%,對(duì)長(zhǎng)鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
4、HPLC純化:

HPLC純化是使用高效液相色譜的原理,對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高,批量效率不高。

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