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細(xì)胞衰老檢測具體方法
點擊次數(shù):575 更新時間:2023-12-11

      細(xì)胞衰老是細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。衰老的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大,呈扁平狀;細(xì)胞核變大,核膜內(nèi)陷,染色質(zhì)聚集、固縮、裂解;胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加,有空泡形成;線粒體的數(shù)目及形狀發(fā)生改變;膜流動性降低;溶酶體內(nèi)容物增多,導(dǎo)致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細(xì)胞所具有的上述特征成為各種細(xì)胞衰老檢測手段的依據(jù)。

其中,對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的檢測是有效檢測細(xì)胞衰老的經(jīng)典方法。X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)是β-半乳糖苷酶的底物,X-Gal本身無色,經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生半乳糖和藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)。利用X-Gal的這個特點,可以間接對β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行測定。衰老細(xì)胞中的溶酶體內(nèi)容物通常增多,使得溶酶體酶β-半乳糖苷酶的活性升高,故可以X-Gal作為底物對細(xì)胞衰老的情況進(jìn)行檢測。

1、細(xì)胞衰老檢測:

(1)細(xì)胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌的細(xì)胞片,每孔加入1×10E5個細(xì)胞,37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞在細(xì)胞片上生長。

(2)在超凈工作臺中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液,加入×1 PBS,洗滌細(xì)胞1次,隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,室溫條件下固定3~5分鐘。

(3)吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,加入×1 PBS,洗滌細(xì)胞3次,每次3分鐘。

(4)吸棄×1 PBS,加X-Gal溶液以浸沒細(xì)胞片為宜,37℃孵育4~8小時或過夜,用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。

(5)取出細(xì)胞爬片,去離子水沖洗2次,再次用固定液固定4分鐘,流水輕輕沖洗。

(6)將細(xì)胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(xiàn)(2分鐘)→95%酒精Ⅱ(2分鐘)→100%酒精I(xiàn)(2分鐘)→100%酒精I(xiàn)(5分鐘)→二甲苯I(2分鐘)→二甲苯Ⅱ(2分鐘)。

(7)中性樹膠封片。

(8)在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細(xì)胞形態(tài)。

每張片子鏡下計數(shù)400個細(xì)胞,確定X-Gal染色陽性細(xì)胞(衰老細(xì)胞)在細(xì)胞群體中的所占的百分比即衰老細(xì)胞率(藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總計細(xì)胞數(shù)×100%)。

2、細(xì)胞衰老檢測注意事項:

①X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

②細(xì)胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈,均會影響后續(xù)的酶反應(yīng)。


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