日本亚洲洲精品码无无专区,丰满人妻熟妇乱又伦精品软件 ,妻子的秘密免费读全文,夜夜精品无码一区二区三区

產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術(shù)與支持 > PCR反應(yīng)的主要物質(zhì)探究
PCR反應(yīng)的主要物質(zhì)探究
點(diǎn)擊次數(shù):203 更新時(shí)間:2024-12-09

      PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+濃度。這些物質(zhì)在PCR反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
1.引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn), 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為宜。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
2.酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3.dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。
在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當(dāng)其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是:溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與
CHCl3抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
5.Mg2+濃度
Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增;濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
綜上所述,PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+。這些物質(zhì)的質(zhì)量和選擇對(duì)于PCR反應(yīng)的成功與否具有重要影響。

 

欧美另类熟妇XXXX久久A片| 久久人人爽人人爽人人片av麻烦 | 国产午夜无码精品免费看性色| 亚洲日韩精品无码专区网址| 日韩a人毛片精品无人区乱码| 久久综合狠狠色综合伊人| 国产成人精品一区二区A片带套 | 亚洲免费在线观看| 亚洲av无码国产一区二区| 全免费a级毛片免费看无码| 欧美RAPPER一姐| 69久久夜色精品国产69| 国产精品日产欧美久久久| 亚洲 欧美 国产 日韩 字幕| 久艾草久久综合精品无码国产| 国产人妻人伦精品无码.麻豆| 亚洲av无码亚洲国产一区| 久久综合九色综合欧美狠狠| 久久变态刺激另类SM孕妇| 精品丰满人妻无套内射| 麻豆熟妇人妻XXXXXX| 熟女人妻大叫粗大受不了| 欧美一进一出抽搐大尺度视频| 亚洲欧美色一区二区三区| 中文字幕久久熟女蜜桃| 国产男女无遮挡猛进猛出| 直接观看黄网站免费视频| 无码人妻精品一二三区免费| 久久久久人妻精品区一三寸| 国内精品久久久久久99蜜桃| 欧美孕妇变态重口另类| 欧美性猛交AAAA片黑人| 精品亚洲成A人7777在线观看| 朋友的丰满人妻hd中文| 国产免费人成在线视频| 欧美视频毛片在线播放| 亚洲综合国产成人丁香五月激情| A级毛片高清免费视频在线播放| 久久99精品久久久久麻豆| 亚亚洲精品黑人巨大在线播放 | 欧美一区二区三区放荡人妇|