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一文與您分享RT-PCR試劑盒的使用步驟
點(diǎn)擊次數(shù):60 更新時(shí)間:2025-04-22
  RT-PCR試劑盒采用UDG酶+dUTP防污染體系,內(nèi)置內(nèi)參基因?qū)φ?,符合CE-IVD及NMPA認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn),適配主流熒光定量PCR儀。廣泛應(yīng)用于新冠病毒等RNA病毒檢測(cè),以及基因檢測(cè)、環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域,為臨床診療、疫情防控及科研提供高特異性、重復(fù)性(CV<5%)的精準(zhǔn)分子診斷解決方案。
 
  為了確保RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,正確使用至關(guān)重要。以下是詳細(xì)的使用步驟,希望對(duì)您有所幫助。
 

 

  1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
 
  在開始實(shí)驗(yàn)之前,確保所有需要的設(shè)備和試劑都已準(zhǔn)備好,并處于工作狀態(tài)。
 
  設(shè)備:包括離心機(jī)、PCR儀、微量移液器等。
 
  試劑:檢查RT-PCR試劑盒中的所有成分是否齊全且未過期。通常包含反轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs、緩沖液、DNA聚合酶、熒光染料或探針等。
 
  2、樣品處理
 
  根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟杉疪NA樣品。對(duì)于RNA樣品的處理需要注意以下幾點(diǎn):
 
  純度與完整性:使用高質(zhì)量的RNA提取方法以保證RNA的純度和完整性??梢酝ㄟ^分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280比率來評(píng)估RNA的質(zhì)量。
 
  防止降解:RNA易被RNase酶降解,因此在整個(gè)操作過程中要采取措施防止污染,如佩戴手套、使用無RNase的耗材。
 
  3、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
 
  將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
 
  設(shè)定反應(yīng)體系:按照說明書推薦的比例混合反轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs、緩沖液和RNA模板。每個(gè)樣本的總體積應(yīng)保持一致。
 
  溫控程序:根據(jù)所使用的反轉(zhuǎn)錄酶的不同,設(shè)置合適的溫度和時(shí)間參數(shù)。一般情況下,先進(jìn)行退火步驟使引物與模板結(jié)合,然后是延伸步驟合成cDNA。
 
  4、qPCR反應(yīng)
 
  利用上一步得到的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。
 
  配置反應(yīng)體系:向每個(gè)PCR管中加入適量的cDNA、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物以及熒光染料或探針。混勻后短暫離心以去除氣泡。
 
  運(yùn)行PCR循環(huán):將反應(yīng)管放入PCR儀中,設(shè)置適當(dāng)?shù)淖冃?、退火和延伸溫度及時(shí)間。每次循環(huán)后,儀器會(huì)自動(dòng)讀取熒光信號(hào)強(qiáng)度,用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物積累情況。
 
  5、數(shù)據(jù)分析
 
  完成PCR后,使用專用軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
 
  基線調(diào)整:確定基線范圍,排除背景噪音干擾。
 
  閾值設(shè)定:選擇一個(gè)合適的熒光閾值,使得各孔的Ct值(Cyclethreshold)能夠反映初始模板量。
 
  結(jié)果解釋:通過比較不同樣本間的Ct值差異,計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平或者絕對(duì)拷貝數(shù)。
 
  RT-PCR試劑盒遵循上述步驟并注意細(xì)節(jié)可以有效地利用開展科學(xué)研究,獲得可靠的結(jié)果。正確的操作不僅有助于提高實(shí)驗(yàn)效率,還能延長(zhǎng)設(shè)備和試劑的使用壽命。
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