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ELISA實(shí)驗(yàn)是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。
ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：
1. 洗滌參數(shù)：
- 洗滌量：自動(dòng)洗板機(jī)通常建議使用350µl的洗滌液來確保清洗整個(gè)反應(yīng)孔的壁。洗滌量應(yīng)比包被體積稍高，以減少未結(jié)合抗體的背景信號(hào)。
- 均勻性：所有反應(yīng)孔的洗滌量必須一致，確保每次洗滌都達(dá)到相同的效果。
2. 洗滌次數(shù)：
- 一般建議：在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌3次。對(duì)于用戶包被的ELISA板，可能需要優(yōu)化洗滌次數(shù)，因?yàn)榘黄桨逋ǔＰ枰南礈齑螖?shù)較少。
- 平衡背景與信號(hào)：過多的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度，而過少則會(huì)導(dǎo)致背景值升高。因此，需要找到一個(gè)平衡點(diǎn)。
3. 洗板方法：
- 自動(dòng)洗板機(jī)：使用洗板機(jī)可以減少人為因素，提高速度和一致性，但需確保洗板機(jī)設(shè)置正確，包括洗滌量和次數(shù)。
- 手工洗板：手工洗板時(shí)，要注意洗液不要溢出孔外，加洗液后靜置1分鐘，然后大力拍干，確?？變?nèi)無殘留液。
4. 洗液：
- 配置：使用新鮮的、高質(zhì)量的超純水或雙蒸水配制洗液，避免使用受污染的水。
- 稀釋倍數(shù)：按照試劑盒說明書稀釋，過高或過低的稀釋倍數(shù)都可能影響洗滌效果。
5. 注意事項(xiàng)：
- 避免污染：每次加樣和洗滌后，應(yīng)更換封板膜，防止交叉污染。
- 拍板技巧：手工洗板時(shí)，拍板要用力但避免過度，以確保孔內(nèi)無殘留液，同時(shí)防止樣本干涸。
- 重復(fù)性：確保每次操作的加樣量、時(shí)間和條件一致，以提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
6. 溫度控制：
- 溫育：溫育溫度通常為37℃，應(yīng)嚴(yán)格控制，避免溫度波動(dòng)影響反應(yīng)。
- 避免邊緣效應(yīng)：使用水浴或加熱板使整個(gè)板達(dá)到均勻溫度，減少邊緣孔與中心孔的溫差。
7. 顯色與終止：
- 顯色時(shí)間：根據(jù)試劑盒說明控制顯色時(shí)間，避免過長(zhǎng)導(dǎo)致背景增高或過短導(dǎo)致結(jié)果偏低。
- 終止液：加入終止液時(shí)要確保無氣泡，終止反應(yīng)后立即讀數(shù)。
8. 問題排查：
- 背景高：可能是洗滌不徹di或洗滌次數(shù)不足。
- 白板：可能是忘記加酶或顯色液，或試劑污染。
- 重復(fù)性差：檢查加樣量、操作時(shí)間和條件是否一致，以及樣本和試劑的穩(wěn)定性。
遵循這些關(guān)鍵點(diǎn)和注意事項(xiàng)，可以有效提高ELISA實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
