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解答:ELISA試驗時稀釋工作的必要性
點擊次數(shù):794 更新時間:2018-12-17
   在進行ELISA試驗時,我們需要將ELISA實驗的樣本進行稀釋工作,這時就會有人來問,為什么ELISA實驗的樣本都要進行稀釋工作,接下來小編就為大家解答一下。
  原因一:競賽抑制比較顯著,應稀釋競賽物;
  原因二:以下降非特異性反響,使特異性的抗原抗體反響充分體現(xiàn)出來。血清稀釋用一般的PBS即可,可加1%的BSA,能有用下降ELISA本底,當然假如你嫌費事我覺得用生理鹽水代替PBS關(guān)系也不大。不論你是用直接競賽仍是直接競賽,血清的稀釋倍數(shù)肯定要事前斷定,但也不必一點點,你做一個預試驗即可,挑選OD在1.0左右的稀釋倍數(shù),即你的競賽ELISA中陰性孔OD在1.0,這樣作出來的曲線比較敏感。
  ELISA試劑盒試驗稀釋血清的過程:
  先把蛋白稀釋必定的倍數(shù),比如說10倍、20倍稀釋(這樣能夠大體斷定一個參數(shù)),將抗原進行一系列稀釋包被微量反響板,再用必定稀釋度的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷,再加酶結(jié)合物進行反響,經(jīng)孵育洗刷后,加底物溶液顯色,停止反響后別離測定O.D值,挑選O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要挑選那個O.D值稍大于1.0,而不挑選小于1.0的抗原濃度。陰性參閱血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值有顯著不同。
  除此之外,ELISA試驗中還會遇到各種各樣的問題,作為實驗者需要及時找出處理的方法,包括:
  1、洗板:1)采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉;2)反應板過多造成洗板等待時間長;
  3)采用半自動洗板機洗板時,洗液量不足,導致洗板不*;洗板針堵塞,抽吸不*;洗板不暢,導致洗板效果差。
  解決方法:1)保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;2)合理安排,或多用幾臺洗板機。
  2、顯色:1)加顯色劑時濺出孔外造成液體回流;2)顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑。
  解決方法:1)加樣時保持顯色劑不外流;2)顯色劑盡量在臨用前配制,堅持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。
  3、終止:可能原因如加終止液時產(chǎn)生較多氣泡,導致假陽性增加。所以在加終止液時應避免產(chǎn)生氣泡。
  4、讀板:如讀板時板底不清潔等。應保證酶標板清潔。所以在整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;盡可能實現(xiàn)ELISA檢測標準自動化,有效提高檢測質(zhì)量。
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